최근 대한내과학회지에 게재된 Mycobacterium bovis 인체 감염 증례[1]를 흥미롭게 읽었습니다. 현재까지 국내에 M. bovis 감염보고가 없던 상황에서 비록 내국인이 아닌 베트남 이주민에서 발생한 증례이기는 하지만 국내 첫 보고라는 중요한 임상적 의의가 있다고 판단됩니다. 본 증례보고는 질환을 일으킨 원인균이 사람에서 결핵을 일으키는 가장 흔한 균인 Mycobacterium tuberculosis가 아닌 M. bovis라는 것을 확인하는 것이 가장 중요합니다. 이와 관련하여 몇 가지 사항을 지적하고 싶습니다.
저자 선생님들께서 기술한 바와 같이 M. tuberculosis complex (MTBC)는 M. tuberculosis 이외에도 M. bovis, M. africanum, M. microti 등이 속해 있습니다[1]. M. tuberculosis와 M. bovis는 모두 사람에서 결핵(tuberculosis)를 일으키며, 임상적 소견과 방사선학적 소견 뿐만 아니라 도말과 배양 등 일반적으로 병원 검사실에서 시행하는 검사에서는 두 균이 구별되지 않습니다[2]. 본 증례보고에서는 M. bovis를 확인한 방을 아래와 같이 기술하고 있습니다.
첫째, "파라핀 포매 조직을 이용한 Real-Time PCR MTB & NTM Kit (BioSewoom, Seoul, Korea)을 시행"하였고, "이 검사에서 MTBC는 IS6110 부위를 대상으로 TB TaqMan probe를 사용"하여 "최종적으로 환자의 검체와 M. bovis BCG strain Monreau RDJ와 염기서열에 대한 상동성은 100%로 확인"되었습니다(논문의 Monreau는 Moreau를 잘못 표기한 것으로 보입니다) [1]. 하지만 IS6110을 이용한 핵산증폭검사는 MTBC 내의 각 균을 구분하지 못하며 사용하신 상업화된 검사도구도 마찬가지로 M. tuberculosis와 M. bovis를 구분하지 못하는 것으로 알고 있습니다. 두 균은 핵산이 99.9% 일치하며 16S rRNA 염기서열도 같다고 합니다[3]. 파라핀 포매 조직에서 염기서열분석을 통해 M. bovis를 확인하였다면 어떤 유전자를 대상으로 하였는지 등 구체적인 방법이 기술되어야 할 것입니다. 그리고 본 증례의 제목은 "M. bovis 감염"인데 결과에서는 확인된 균주가 "M. bovis BCG strain Moreau"라고 하였습니다. 두 균주는 특성 및 감염 경로가 분명하게 다르다는 것을 고려할 때, 균주의 명칭을 혼용하여 사용하는것은 적절하지 않다고 봅니다.
둘째, "재원 25일에 Real-Time PCR MTB & NTM Kit (BioSewoom, Seoul, Korea)을 통해 M. bovis에 의한 감염으로 진단"하였는데, 위에서 말씀 드린 바와 같이 이 제품은 M. tuberculosis와 M. bovis를 구분하지 못합니다. 위 검사기기를 통해 어떻게 이를 확인하였는지 구체적인 기술이 필요합니다.
셋째, "내원 3개월 후 흡인액에서 시행한 결핵균 배양 검사상 M. bovis가 배양"되었습니다[1]. 국내 검사실에서는 배양된 항산균을 결핵균(MTBC)과 비결핵항산균(nontuberculous mycobacteria)으로 구분하여 보고하고 있습니다[4]. 배양 검사로는 M. tuberculosis와 M. bovis를 구분하지는 못하는 것이 사실입니다. 따라서 배양된 균으로 추가 균동정 검사를 실시 하였다면 그 부분이 기술되어야 합니다.
넷째, "내원 4개월 후 항결핵제 감수성 검사에서 모든 약제에 감수성이 있음을 확인"하였습니다[1]. 하지만 M. bovis는 M. tuberculosis와 달리 본래부터 pyrazinamide에 내성을 가지고 있습니다[5]. 약제감수성 검사에서 다른 항결핵제에는 감수성을 보이면서 pyrazinamide에 내성을 보이는 소견은 원인균이 M. tuberculosis가 아닌 M. bovis 가능성을 임상적으로 의심하게 하는 매우 중요한 단서가 됩니다[5].
결론적으로 본 증례보고는 파라핀 포매 조직의 염기서열분석, 상품화된 Real-Time PCR Kit, 배양 검사 그리고 약제감수성 검사 등 여러 검사를 통해서 원인균이 M. tuberculosis가 아닌 M. bovis라는 것을 확인하였다고 하였지만, 그 구체적인 결과를 기술하지 않고 일부 검사결과는 기존의 문헌보고와 반대되기도 합니다. 추후 타 연구자의 혼동 및 인용을 피하기 위하여 본 증례의 원인균이 어떻게 M. bovis로 확인되었는지를 추가로 밝혀주시는 것이 필요할 것으로 사료됩니다.
답 신
먼저, 독자께서 저자들의 ‘국소적 농흉으로 나타난 Mycobacterium bovis 감염 1예’에 깊은 관심을 가져주셔서 감사합니다[1]. 독자께서 저자들이 보고한 증례에 대한 진단방법에 있어 의문을 제기하셨습니다.
본 증례에서는 최초 진단 시, 흉수천자로 얻은 흉수 및 흉막생검 조직, 가래 검체를 이용한 항산균 도말 검사와 PCR 검사에서 음성이었고, 파라핀 포매 조직으로 국내 시판된 결핵 진단용 primer을 이용한 nested PCR 검사를 하였으나 음성이었습니다. 두번째 흉막박피술에서 얻은 검체를 이용한 항산균 도말 검사에서 양성이었으나 파라핀 포매 조직을 이용한 nested PCR검사에서 음성이었습니다.
추가 검사를 위해 국내 실험실(Biosewoom®)에 의뢰하여 다음과 같은 방법으로 검사를 시행하였습니다. Forward primer는 16s ribosomal RNA gene에 위치하도록 하였고, reverse primer는 16s rRNA gene과 23s rRNA gene 사이에 있는 internal transcribed spacer 부위에 위치하도록 하여 nested PCR을 시행하였습니다[2]. 이러한 과정으로 통해 얻은 핵산 증폭물에 대해 염기서열을 분석하여 M. bovis가 유력하다는 보고를 받았습니다. 이후 3개월 뒤에 균이 배양되어 증례보고를 하게되었습니다.
독자께서 지적하셨듯이 본 증례에서 이용한 방법으로 얻은 핵산 증폭물에 대해 염기서열을 분석하는 방법은 M. tuberculosis complex의 감별에는 도움이 됩니다. 그러나 M. tuberculosis와 M. bovis 균주들은 유전학적으로 99.9%의 상동성을 보이기 때문에 염기서열 분석으로는 감별이 어렵습니다. 최근에는 M. bovis의 여러 균주를 감별하기 위해 spacer oligonucleotide typing (spolingotyping)과 variable number tandem repeats 등의 방법들을 이용하고 있습니다[3].
독자께서 지적하신 첫번째, 두번째 사항에서 제기하신 대로 문제점을 확인하고자 저자들은 문헌고찰 및 검증을 위해 이전 검사실이 아닌 다른 기관에 의뢰하여 이전 진단방법이 아닌 파라핀 포매 조직을 이용한 Real-time PCR (실시간 중합효소연쇄반응) 검사를 시행하였습니다. Seeplex MTB/NTM kit (Seegene, Seoul, Korea)을 사용하여 MTB complex에 특이적인 IS6110, MPB64 부위에 대해 Real-time PCR 검사를 시행한 결과, MTB complex 양성이었습니다[4]. 이전 결과에서 M. bovis BCG, strain Moreau RDJ였으므로 이를 확인하기 위해 추가적인 검사를 시행하였습니다[5]. M. tuberculosis 및 다른 M. bovis 또는 M. bovis BCG 등을 구별하기 위해 M. tuberculosis와 차이가 있는 region of difference (RD) 부위의 RD1 및 RD4 부위에 대해 일반 PCR 검사와 nested PCR 검사를 하였지만 gDNA 양이 적어 PCR을 수행하지 못하였습니다. 지금까지의 결과로는 본 증례의 원인균에 합당한 소견은 없었습니다.
독자께서 세번째, 네번째 사항에서 제시하셨듯이 M. tuberculosis와 M. bovis 균주를 일반적인 검사실에서 시행하고 있는 항산균 도말검사와 결핵 배양 검사에서 두 균주를 감별하기 어렵습니다. 또한 유전학적으로 99.9%의 상동성을 가지고 있기 때문에 분자학적 방법인 PCR 등의 방법으로도 구분하기 어렵습니다. 결과 확인 후 추가 검사를 통한 확인과정이 있어야 함에도 시행하지 못하였습니다.
결론적으로 PCR 검사법을 통한 결과와 증례에서 언급한 것 같이 항결핵제 감수성 검사에서 pyrazinamide 감수성을 보인 점을 고려한다면 독자께서 지적하신 것과 같이 M. bovis 균주가 아닐 가능성이 높습니다. 따라서 본 증례에서 배양된 균주를 다시 배양하는 과정이 필요하나 현재 보관된 균주가 없어 이를 확인하는데 제한이 있습니다. 따라서 독자께서 지적하셨듯이 본 증례의 원인균이 M. bovis이라고 단정하는데는 제한이 있습니다.
결핵진단 과정에 있어, 결핵 확진 검사인 배양 검사에는 많은 시간이 필요로 하기 때문에 소요되는 시간을 줄이고자 하는 노력이 있습니다. 이러한 노력으로 흔히 사용하게 되는 방법이 여러 PCR 방법을 이용하는 것입니다. 그러나 검사결과를 분석함에 있어 주의가 필요하고, M. tuberculosis 이외의 원인균을 확인하는 방법으로 차등 유전자를 이용한 검사 등 여러 방법들이 앞으로 진단에 있어 도움이 되리라 생각됩니다. 또한, 보통 PCR 검사를 일반적 결핵균 배양 검사의 결과를 확인하기 전에 시행된다는 점을 감안한다면, 결핵균 배양 양성일 경우, 추가적인 검사들을 고려하여 정확한 검사결과를 얻기 위해 노력해야 할 것입니다.
REFERENCES
1. Lim SK, Park JY, Park SD, Chang HK. Localized Empyema due to Mycobacterium bovis. Korean J Med 2011;81:792–796.
2. Han XY, Pham AS, Tarrand JJ, Sood PK, Luthra R. Rapid and accurate identification of mycobacteria by sequencing hypervariable regions of the 16S ribosomal RNA gene. Am J Clin Pathol 2002;118:796–801.
3. Gibson AL, Hewinson G, Goodchild T, Watt B, Story A, Inwald J, Drobniewski FA. Molecular epidemiology of disease due to Mycobacterium bovis in humans in the United Kingdom. J Clin Microbiol 2004;42:431–434.
4. Drews SJ, Eshaghi A, Pyskir D, et al. The relative test performance characteristics of two commercialassays for the detection of Mycobacterium tuberculosis complex in paraffin-fixed human biopsy specimens. Diagn Pathol 2008;8:3–37.
5. Lee HR, Kim SY, Chang HE, et al. Novel multiplex PCR using dual-priming oligonucleotides for detection and discrimination of the Mycobacterium tuberculosis complex and M. bovis BCG. J Clin Microbiol 2010;48:4612–4614.
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