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서 론

Pseudomonas aeruginosa는 중환자실에서 흔히 분리되는 균으로서 인공호흡기-관련 폐렴, 요로감염 및 혈관카테터-관련 감염의 중요한 원인균이다¹⁾. P. aeruginosa는 β-lactamase 외막 투과의 변화 및 efflux pump 등의 기전으로 여러 약제에 본태적으로 내성이면서 플라스미드 매개로 aminoglycoside 분해효소, β-lactamase 및 carbapenemase 유전자를 획득하여 사용할 수 있는 모든 항생제에 내성인 전약제 내성(pandrugresistance)을 보이곤 한다²⁾.

따라서 P. aeruginosa 다약제 내성균 감염의 치료를 위하여 혹은 치료 중 내성균이 발현되는 것을 억제하기 위하여 항생제 상승효과를 이용한 항생제 병합요법이 많이 연구되었고 임상적으로 이용되고 있다^3-9). P. aeruginosa 감염증의 치료에서 병합요법으로 흔히 이용되는 항생제는 β-lactam과 aminoglycoside 혹은 β-lactam과 fluoroquinolone이다. 일반적으로 β-lactam과 fluoroquinolone 혹은 aminoglycoside의 병합시 항생제에 감수성이 있는 경우 상승효과를 보인다고 알려져 있으나 균이 항생제에 내성인 경우에는 항생제 병합요법의 효과, 살균력 및 내성의 억제에 관한 자료가 불충분하다^3,5-9). 국내 중환자실에서 분리되는 P. aeruginosa 균들은 aminoglycoside와 fluoroquinolone에 내성이 높아서 임상적으로 병합요법을 사용하기 어려운 경우가 많다. 특히 carbapenem 단일약제에만 감수성이 있는 균주가 흔히 발견되고 carbapenem 단독요법으로 치료할 경우 짧은 기간 내에 carbapenem 내성이 발현되어 전약제 내성균으로 균이 바뀌는 것을 흔히 경험하게 된다. 한편, 전약제 내성균 감염에 사용되는 polymyxins은 국내 수급이 불안정하고 신장 독성이 과도하게 높아서 중환자에서 사용시 주의를 요한다¹⁰⁾.

이에 저자들은 P. aeruginosa 임상분리균주들 중 β-lactam, carbapenem, aminoglycoside 및 fluoroquinolone에 다양한 내성을 보이는 균들을 선택하여 checkerboard 방법 및 In vitro kinetic 모델을 이용하여 β-lactam과 amikacin 혹은 ciprofloxacin의 항균제 병합요법 효과를 관찰하고 각 항균제의 MIC (minimum inhibitory concentration)과의 상관관계를 분석하여 다약제 내성균의 적절한 치료 지침을 제시하고자 하였다.

대상 및 방법

대상균주: β-lactam에 다양한 내성을 보이며 내성 기전이 밝혀진¹¹⁾ 임상균주 44주 중 amikacin의 MIC가 2~256 μg/mL로 다양하고 ciprofloxacin의 MIC도 0.06~128 μg/mL까지 다양한 10개의 균주를 선택하였다. 이들은 1997년 중 단국대학교병원, 삼성의료원, 아산병원 및 한림대학교 병원의 환자들에서 동정된 균주들이었다.

항생제 및 감수성 검사: 실험에 이용한 항생제는 meropenem(Yuhah Co., Seoul, Korea), ceftazidime (GSK Korea, Seoul, Korea), piperacillin/tazobactam (Wyeth Korea, Inc., Seoul, Korea), ciprofloxacin (Bayer Korea, Seoul, Korea) 및 amikacin (Yungjin Pharm, Co., Seoul, Korea)이었다.

MIC는 CLSI의 표준지침대로 agar dilution test로 측정하였다¹²⁾. P. aeruginosa ATCC 27853균주를 정도관리균주로 이용하였다.

Checkerboard법을 이용한 항생제 병합 효과의 측정: Checkerboard 방법은 기존의 방법에 따라 수행하였다¹³⁾. Mueller-Hinton agar에 밤새 배양한 집락을 따서 McFarland 0.5에 맞추어 접종에 이용하였다. 96 well plate에 병합요법을 시험할 두 종류의 항생제를 최고 농도에서 2배씩 연속적으로 희석하여 한 약제는 수평축으로 다른 약제는 수직축으로 각 well에 연속적인 희석액을 0.25 mL씩 접종하였다. 이후 균 접종액 0.5 mL를 넣어 최종 용량이 1 mL가 되게 하고 이를 37℃에 16시간 배양한 후 바닥의 균 배양 여부에 따라 isobologram을 그렸다.

Fractional inhibitory Index (FIC): FIC index는 기존의 방법대로 Σ FIC=(A)/MIC_A+(B)/MIC_B의 공식을 이용하여 구하였다¹³⁾. 여기서 A는 A 희석열에서 억제효과를 보이는 최소 농도이고 B는 B열에서 억제효과를 보이는 최소 농도이며 MIC_A와 MIC_B는 각각 A와 B의 최소억제농도이다. FIC index가 ≤0.5이면 synergism, >0.5~4이면 indifference, >4이면 antagonism으로 정의하였다.

In vitro time kill assay: Checkerboard법에서 확인된 항생제 상승효과를 확인하기 위하여 amikacin과 ciprofloxacin에 다양한 MIC를 보이는 6균주를 선택하여 각각 ceftazidime, piperacillin/tazobactam, meropenem 단독 약제와 ciprofloxacin 혹은 amikacin을 병합한 후의 항균제 상승효과를 In vitro time kill assay 방법으로 관찰하였다^3,13). 각각의 항생제 농도는 일반적인 용량 단일 투여시 혈중 최고 농도와 항균제 감수성 검사의 기준을 참조로 하여 정하였다^5,9,14-16). Amikacin과 ciprofloxacin은 각각 32와 2 μg/mL에서 실험하였고, cephalosporin 32 μg/mL, piperacillin/tazobactam 128/4 μg/mL, meropenem 16 μg/mL의 농도를 이용하였다.

접종균이 로그성장기에 있을 때 균을 취하여 5×10⁵ CFU을 최종 접종하였다. 각각 항생제를 포함한 배지에서 배양하면서 0, 2, 4, 8, 24시간에 균액을 취하였다. 이를 0.9% 생리식염수로 적당 배수 희석하여 20 μL씩 두 쌍의 TSA배지에 잘 펴서 접종하였고, 이를 37℃에 16~24시간 배양 후 균 집락 수를 세어서 평균값을 구하였다. 모든 실험에 항생제를 포함하지 않는 배지에 균을 접종한 대조군을 포함시켰다. 각 값은 log₁₀ CFU/mL과 시간을 축으로 그래프를 그렸고 24시간에 2 log₁₀ 이하의 감소를 보일 때 상승효과로 판정하였다.

결 과

항균제 감수성 결과: 각 균의 ceftazidime, cefepime, piperacillin/tazobactam, meropenem, ciprofloxacin 및 amikacin의 MIC는 table1에 있다. 모든 균주가 ceftazidime, cefepime, piperacillin/tazobactam, meropenem에 내성이었고. ciprofloxacin과 amikacin에 대해서는 다양한 내성 양상을 보였다.

Checkerboard법에 의한 항균제 병합요법의 효과 측정: 표 1은 ceftazidime, cefepime, piperacillin/tazobactam, aztreonam 및 meropenem을 각각 ciprofloxacin 및 amikacin과 병합하였을 때 효과를 checkerboard법으로 측정하여 FIC index를 구한 값이다. 전반적으로 ciprofloxacin에 비하여 amikacin을 병합하였을 때 상승효과가 높았다. Ciprofloxacin은 MIC가 1 μg/mL이었을 때는(71번 균주) 실험에 포함된 모든 β-lactam과 상승 효과를 보이지만, MIC가 4 μg/mL이었을 때는 실험에 포함된 β-lactam의 MIC가 낮은 경우 상승효과를 보이는 반면(58번 균주) 실험에 포함된 β-lactam의 MIC가 높은 경우 indifference 효과를 보였다(10번 균주). Ciprofloxacin MIC가 16 μg/mL 이상인 균주에서는 모두 indifference 효과를 보였으나 antagonism 효과는 관찰되지 않았다.

Table 1.

The MICs using broth microdilution and checkerboard synergy results

반면에 amikacin은 MIC가 128 μg/mL인 경우도 실험에 포함된 모든 β-lactam과 병합시 상승효과를 보였다.

In vitro time kill assay: Checkerboard법에서 상승효과를 보인 균주들도 상승효과를 보인 약물 농도가 임상적으로 혈중 농도에 도달할 수 없는 높은 경우가 많아서 체내에서 과연 상승효과를 보일지 확실하지 않았다. 혈중 농도에서 상승효과가 발생하는지를 확인하기 위하여 각각 amikacin과 ciprofloxacin의 MIC가 다양한 4균주를 선택하여 항생제의 혈중 농도에서 두 약제를 병합할 때 어떤 상호작용을 보이는지 killing curve를 그려서 관찰하였다. Ceftazidime 32 μg/mL, piperacillin/tazobactam 128/4 μg/mL, meropenem 16 μg/mL, ciprofloxacin 2 μg/mL 혹은 amikacin 32 μg/mL 농도의 배지에 단독 배양한 경우와 ceftazidime, piperacillin/tazobactam 및 meropenem과 ciprofloxacin 혹은 amikacin을 병합한 경우의 배양액내 시간별 균의 밀도를 확인하였다. 결과는 그림 1과 그림 2와 같다.

Figure 1.

Killing curve at ciprofloxacin 2 μg/mL for isolates 6 (A) and 10 (B). Either 32 μg/mL of ceftazidime or 16 μg/mL of meropenem was added. CAZ, ceftazidime; CIP, ciprofloxacin; MEM, meropenem.

Figure 2.

The killing curve at amikacin 32 μg/mL for isolates 72 (A) and 81 (B). Thirty-two μg/mL of ceftazidime, 128/4 μg/mL of piperacillin/tazobactam, or 16 μg/mL of meropenem were added. AMK, amikacin; CAZ, ceftazidime; MEM, meropenem; P/T, piperacillin/ tazobactam.

Ciprofloxacin과 ceftazidime, piperacillin/tazobactam 혹은 meropenem을 병합하여 배양한 결과는 그림 1과 같다. Ciprofloxacin의 MIC가 16 μg/mL이었던 6번과 53번 균주 모두 meropenem과 ciprofloxacin을 병합하였을 때 상승효과를 보였고, checkerboard법에서 equivocal한 효과를 보였던 6번 균주는 ceftazidime과 ciprofloxacin 병합한 배지에 배양할 때 상승효과를 보였다. 두 균주 모두 checkerboard법에서 상승효과를 보이지 않았다. 71번균주는 ciprofloxacin MIC가 1 μg/mL로 배양액 내 ciprofloxacin 농도보다 낮아서 ciprofloxacin 단독 혹은 ciprofloxacin과 meropenem병합 배지에서 24시간에 균이 살균되어 상승효과를 확인할 수 없었고, 10번 균주는 meropenem MIC가 배양액내 농도보다 낮아서 역시 meropenem 단독 혹은 meropenem과 ciprofloxacin 병합 배지에서 24시간에 살균되어 상승효과를 확인할 수 없었다.

Amikacin과 ceftazidime, piperacillin/tazobactam 혹은 meropenem의 병합 배양의 결과는 그림 2와 같다. 72번 균주와 81번 균주는 checkerboard법에서 상승효과를 보였던 ceftazidime이나 piperacillin/tazobactam에서는 상승효과를 보이지 않은 반면, meropenem과 병합할 때 상승효과를 보였다(그림 2). 53번과 71번은 amikacin 단독 배양에서 살균효과가 발생하여 병합 배양의 효과를 확인할 수 없었다.

고 찰

다약제 내성 그람 음성균은 병원 감염의 중요한 원인균이다. 그 중 P. aeruginosa는 특히 중환자실을 중심으로 여러 병원 감염의 가장 중요한 원인균이다¹⁾. P. aeruginosa의 β-lactam에 대한 내성 기전은 β-lactamase의 생산, 외막투과성의 변화 및 다약제 내성 펌프의 활성화 등이고 이들 기전이 단독으로 혹은 병합하여 내성을 일으킨다. 다약제 내성 펌프의 활성화는 fluoroquinolone 등에 의하여 유도되는데, 다른 계열의 여러 가지 약제에 동시내성을 일으켜서 문제이다²⁾.

국내 중환자실에서 분리되는 P. aeruginosa의 항균제 내성은 매우 높다. 2004년 7~10월 국내 16개 병원 중환자실을 대상으로 수행한 전향적 연구의 결과, P. aeruginosa의 ceftazidime 및 imipenem 내성률은 각각 40% 및 17%였고, Acinetobacter spp.의 ceftazidime 및 imipenem 내성률은 각각 77% 및 17%였다¹⁷⁾. P. aeruginosa는 항생제를 단독으로 사용하는 경우 항생제 내성이 쉽게 발현하여 β-lactam을 사용할 때 aminoglycoside나 fluoroquinolone을 병합할 것을 권장한다²⁾. 그러나 국내의 중환자실의 경우 P. aeruginosa의 fluoroquinolone이나 aminoglycoside 내성률이 높아서 병합요법이 용이하지 않다. Fluoroquinolone이나 aminoglycoside에 내성인 균에서 fluoroquinolone이나 aminoglycoside를 다른 약제와 병합하여 투여할 때 내성균 발현의 억제나 상승효과를 보일지는 아직 알려져 있지 않다. 2006년 In vitro killing assay를 통하여 fluoroquinolone이나 carbapenem에 내성인 P. aeruginosa에서도 두 약제를 병합 투여하면 내성균 발현이 억제된다는 논문이 출판되었다⁶⁾. 본 연구자의 결과에서도 In vitro killing assay를 수행한 두 균주 모두가 meropenem과 ciprofloxacin에 내성인 균주인데도 meropenem과 ciprofloxacin 혈중농도에서 상승효과를 보였다. 또한 CLSI 기준상 meropenem에 내성이지만 일반적인 용량을 투여할 때 혈중 농도에서 단독으로 혹은 역시 내성인 ciprofloxacin이나 amikacin을 동시에 투여할 경우 균이 억제된다는 것을 확인할 수 있었다. 반면에 ceftazidime이나 piperacillin/tazobactam은 내성 기준이나 혈중 농도에 비하여 내성의 수준이 매우 높은 균들이 많아서 일반적인 용량의 약물 투여로는 내성이 극복되지 않는 것으로 생각된다.

본 실험에서 checkerboard법과 In vitro killing assay의 결과가 일치하지 않는 균주가 많았다. Checkerboard에서 보면 많은 균주들이 amikacin의 MIC에 상관없이 cephalosporins, piperacillin/tazobactam 및 meropenem과 좋은 상승효과를 보였다. 그러나 In vitro killing assay를 수행한 4균주 중 병합요법을 볼 수 있었던 2균주에서는 checkerboard 결과와는 달리 meropenem과만 상승효과를 보여주었다. Checkerboard 방법은 96 well plate에 2배 간격으로 희석하여 검사하므로 저농도에서 고농도까지 실험이 가능하지만 In vitro killing assay에서는 실험 약물농도를 환자에게 일반적인 용량을 투여하였을 때 도달할 수 있는 혈중 농도에 맞추었기 때문에 두 검사가 다른 결과를 보인 것으로 생각되었다. 즉, checkerboard 방법에서는 cephalosporin은 128 μg/mL까지, piperacillin/tazobactam은 512 μg/mL까지 실험하여 항생제 권장량을 투여할 때 혈중에 도달하기 어려운 고농도까지 실험하였고, 대부분의 균주가 MIC보다 높은 고농도에서 synergy를 보였기 때문이다.

P. aeruginosa는 여러 내성 기전을 가지고 있고 한 약물에 여러 내성 기전이 작용하기도 하지만 cephalosporins과 penicillins의 내성 기전은 주로 AmpC β-lactamase의 생산에 의하여 발생하고 AmpC β-lactamase 생산량에 따라 cephalosporins과 penicillins의 MIC 수준이 결정된다¹¹⁾. 이번 실험에 이용한 균주들은 내성 기전이 확인된 균주들로서 특히 균주 81, 10, 79는 AmpC β-lactamase 생산이 표준 균주인 PAO1보다 5배 이상인 효소 과다 생산균들이었고 균주, 72, 71 및 157은 플라스미드 매개 효소를 생산하여서 MIC 수준이 cephalosporins 및 penicillins 약물 혈중 도달 농도에 비하여 매우 높다¹¹⁾. 따라서 혈중 농도에서 과연 checkerboarder 방법의 결과처럼 synergy를 보일 것인가를 확인하기 위하여 In vitro killing assay를 할 때 penicillins 혹은 cephalosporins의 내성 수준이 높은 균들을 선택하여 실험하였으므로 두 검사의 일치 정도가 낮았을 것으로 생각된다.

반면에, 모든 실험 균주 들의 meropenem 내성 기전은 OprD 소실에 의한 것이었고, 이 중 53과 60은 OprD 소실과 더불어 MexAB-OprM efflux의 과잉 표현이 있었다. OprD 소실에 의한 carbapenem 내성 기전은 penicillins이나 cephalosporins에 비하여 혈중 약물 농도와 비교하여 보면 내성 수준이 비교적 낮은 편이다. 따라서 이러한 균들은 CLSI 기준에 내성이어도 다른 약제와 병합하여 사용하면 치료에 어느 정도 효과를 거둘 것으로 생각된다.

Amikacin은 checkerboard법에서는 MIC에 상관없이 ceftazidime, cefepime, aztreonam, piperacillin-tazobactam 및 meropenem과 병합투여시 상승효과를 보여주었는데, In vitro killing assay에서는 meropenem과 유일하게 상승효과를 보여주었다. 사용한 균주 중 81번 균주는 amikacin의 MIC가 128 μg/mL로 매우 높았고 meropenem도 16 μg/mL으로 중등도 내성이었지만 두 약제 사용 시 24시간에 균 밀도가 100배 이하로 감소하였다. 72번 균주는 amikacin의 농도는 32 μg/mL로 중등도 내성이었지만 meropenem의 MIC가 >32 μg/mL로 높았고, 이 균주 역시 두 약제 사용시 상승효과를 보여주었다. Amikacin은 고도내성균에서도 meropenem과 병합시 상승살균효과를 보이므로 내성 수준을 모르는 경우에도 meropenem과 병합 사용할 수 있을 것으로 사료되었다.

이번 연구에서는 상승효과의 측정을 주로 checkerboard법으로 하였는데, 혈중 도달 농도 등을 고려할 때 In vitro killing assay가 좀 더 임상 적용이 좋을 것으로 생각된다. 추후 ciprofloxacin과 amikacin에 대하여 다양한 수준의 내성을 보이는 여러 균 들로 In vitro killing assay를 하여서 상승효과를 보이는 대략적인 MIC의 기준을 정할 수 있을지 연구가 필요하다.

결론적으로, 임상에서 다약제 내성 P. aeruginosa에 의한 감염이 발생했을 때 내성 수준을 측정할 수 없을 경우 meropenem과 amikacin을 병합하여 쓰는 것이 안전할 것으로 사료되며, 신장기능 이상 등으로 amikacin 사용이 어려운 경우는 fluoroquinolone을 병합하여 투여하는 것이 좋을 것으로 생각된다. 임상미생물 실험실에서도 전약제 내성 P. aeruginosa 감염증이 발생하는 경우는 checkerboard법 등으로 MIC와 상승효과를 보이는 약제를 대략적으로 선택한 후 필요하면 In vitro killing assay로 확인해 주는 것이 필요할 것으로 사료된다.

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