T 림프구 칼슘신호와 포타슘 이온 전류에 대한 글루코사민의 효과

Effects of glucosamine on Ca2+ signaling and K+ channel currents in T lymphocytes

Article information

Korean J Med. 2010;79(5):536-542
Publication date (electronic) : 2010 November 1
1Department of Physiology, Seoul National University College of Medicine, Seoul, Korea
2Department of Internal Medicine, Graduate School of Medicine, Dongguk University, Seoul, Korea
서은영1, 방발1, 김성준1, 김우경2
1서울대학교 의과대학 생리학교실
2동국대학교 일반대학원 내과학교실
Correspondence to Woo Kyung Kim M.D., Ph.D., Department of Internal Medicine, Graduate School of Medicine, Dongguk University Seoul 100-715, Korea E-mail: popo1hi@yahoo.co.kr
Received 2009 November 10; Revised 2010 May 18; Accepted 2010 July 16.

Abstract

목적

기능성식품 등의 소재로 널리 섭취되는 글루코사민은 항염증작용도 있음이 보고되면서 그 약리기전에 대하여 새롭게 주목받고 있다. T림프구와 같은 면역세포들에서 세포내 칼슘농도([Ca2+]i)의 증가 및 포타슘이온통로의 활성화는 면역세포활성화에 중요함이 잘 알려져 있다. 본 연구는 림프구 칼슘농도와 포타슘이온전류에 대한 글루코사민의 작용여부를 밝히기 위하여 수행되었다.

방법

Jurkat-T 림프구에서 [Ca2+]i와 막전압의존성 포타슘 전류(IKv)는 각각 fura-2 형광분석법과 전세포팻취클램프 방법으로 측정하였다. 칼슘의존성 포타슘전류(IKCa)를 측정하기 위하여, SK4 과발현 HEK-293 세포주에서 inside-out 팻취클 램프를 수행하였다.

결과

항CD3항체에 의한 T세포 수용체 자극은 [Ca2+]i의 뚜렷한 증가를 유발하나, 글루코사민(0.5 mM)의 급성투여는 이에 대하여 별다른 영향을 주지 않았다. 또한 IKv도 변하지 않았다. 장시간 T세포 수용체 자극(24~36 h)은 IKv를 두 배 이상 증가시켰으며, 글루코사민을 병행처치하여도 차단되지 않았다. IKCa는 글루코사민(0.5 mM) 처치에 의하여 약 85%까지 감소하였다.

결론

이상의 결과로 볼 때 일부 연구에서 관찰된 글루코사민의 면역/염증세포 억제효과는 주로 이온통로와 칼슘신호를 매개로 할 가능성은 낮은 것으로 사료된다. 하지만 포타슘이온통로를 통한 항염증 작용의 가능성을 완전히 배제할 수는 없다.

Trans Abstract

Background/Aims

Glucosamine is widely taken as a functional food, and some studies reported its anti-inflammatory effects. K+channels and intracellular signal play important roles in the activation of immune cells such as T lymphocytes. Therefore we aimedto examine the effects of glucosamine on the cell physiological parameters.

Methods

In Jurkat-T lymphocytes, intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) was measured using fura-2 fluorimetry, and voltage-gated K+current (IKv) was measured using whole-cell clamp technique. Ca2+-activated K+ current (IKCa) was measured in HEK293 cells overexpressing SK4 using inside-out patch clamp technique.

Results

An acute application of glucosamine (0.5 mM) affected neither the increase in [Ca2+]i induced by CD3 stimulation(anti-CD3 Ab, 5 μg/mL) nor the IKv in Jurkat-T cells. A chronic stimulation of with anti-CD3 Ab (5 μg/mL, 24~36 hr) largely increasedthe amplitude of IKv. However, the combined treatment with glucosamine (0.1 mM) did not block the increase of IKv. TheIKCa in SK4-overexpressing cells was slightly decreased by glucosamine (0.5 mM).

Conclusions

While glucosamine had a minor inhibitory effect on SK4 K+ channels, the anti-inflammatory effects of glucosaminecould not be explained by the effects on the Ca2+ signaling in T lymphocytes. (Korean J Med 79:536-542, 2010)

서 론

글루코사민은 glycosaminoglycans, proteoglycans, 그리고 연골의 hyaluronan에 자연적으로 존재하는 아민성 단당류이다. 다양한 음식물(게, 굴, 새우 껍질 등)에 풍부한 것으로 알려져 있다. 인체에서의 합성은 나이가 들어감에 따라 점차 감소하는 것으로 알려져 있다. 천연으로는 키틴을 비롯하여 세균의 세포벽, 동물의 연골이나 피부를 구성하는 뮤코다당 등 다당류의 성분으로 널리 분포한다. 또한, 골관절염이나 상해로부터의 손상을 보수하기 위해 필요한 물질을 관절에 제공하여 특히 연골에서 발견되는 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)이라 불리는 뮤코다당류를 만드는 물질이며, 그 외 소화기, 순환기 내의 기초점막, 관절부위의 활액, 인대 및 건을 포함한 신체조직의 대부분을 이루는 물질이다1).

글루코사민은 천연물질 외에도 황산염(glucosamine sulfate, GS)이나 염산염(glucosamine hydrochloride) 형태로 합성되어 사용되고 있다. 글루코사민은 임상적으로 관절염(osteoarthritis)의 증상에 유익한 효과가 있다는 일부 보고2,3)에 따라서 일반인에게 건강보조식품으로 광범위하게 섭취되고 있는 실정이다. 관절연골의 구성성분이므로 연골보호 효과가 있을 것이라는 수준의 논리뿐 아니라, 최근에는 글루코사민이 염증 반응 자체에 대한 억제효과가 있다는 연구결과가 보고된 바 있다4,5). 그러나 글루코사민의 항염증 작용 기전에 대한 자세한 연구는 매우 드물다. NF-kB 의존적인 세포내 신호전달과정이 억제된다는 보고가 있으나6,7) 그 외에는 잘 알려진 바가 없다. 최근의 흥미로운 연구결과로는 글루코사민과 그 대사물이 transglutaminase-2를 억제함으로써 간접적인 메커니즘으로 NF-kB의 활성을 억제하는 것이 항염증 기전을 설명할 수 있다는 보고가 있다8).

만성염증 및 면역반응을 담당하고 있는 세포들, 특히 T 림프구의 신호전달과정 중에서 새롭게 주목 받고 있는 것으로 세포막을 통한 칼슘 유입과 이온통로가 있다. 면역세포 활성화의 가장 중요한 신호기전의 하나는 지속적, 또는 주기적 패턴의 세포내 칼슘농도([Ca2+]i) 증가이다. 면역세포에서 phospholipase C (PLC) 등에 의한 세포내 저장고의 칼슘동원 및 이에 뒤따르는 칼슘유입은 거의 모든 종류의 면역세포에서 다양한 활성반응을 시작하게 하는 근본적인 신호이다9). Ca2+은 거의 모든 유핵세포에서 중요한 2차 전령물질이지만, 림프구를 비롯한 면역세포의 분화, 엑소사이토시스, cytokine 생산, 면역시냅스생성 등에서 특히 중요하다. [Ca2+]c의 증가는 두 가지 경로로 일어난다. (1) 세포내 저장고(endoplasmic reticulum, ER)로부터 IP3 수용체를 통한 유리(Ca2+ release)와 (2) ER의 칼슘저장 고갈(Ca2+ depletion)이 신호가 되어 활성화되는 칼슘통로(Ca2+-release activated Ca2+ channel, 일명 CRAC channel)이 있다9). CRAC channel의 분자적 정체는 2006년 이후 일련의 발견에 의하여 Orai (또는 CRACM)이라고 명명된 세포막단백질에 대한 유전자가 클로닝되면서 밝혀졌다. 이와 함께, ER의 칼슘저장상태(또는 고갈상태)를 감지하여 CRAC을 활성화시키는 STIM1이라는 단백이 ER 지질막에 발현되어 있는 것이 필수적임이 밝혀졌다9). 림프구나 비만세포 등에 높이 발현되어 있는 CRAC channel을 통한 Ca2+ 유입은 면역 반응 유발과 지속에 매우 중요한 역할을 한다. 이러한 사실은, Orai1이나 STIM1의 돌연변이가 사람에게서 심한 선천적 면역결핍을 일으키거나, 생쥐에서 알레르기 반응이 소실되는 등의 결과에서 명확히 드러난 바 있다9).

면역세포의 CRAC channel과 함께 면역질환의 표적으로 주목 받고 있는 것으로 포타슘통로가 있다. 면역세포에 공통으로 존재하는 포타슘통로는 Kv1.3 (voltage-gated K+ channel의 일종)과 IKCa1 (세포내 칼슘농도의 증가에 따라 활성화되는 Ca2+-activated K+ channel의 일종, SK4라고도 불림)이다. 음성으로 과분극(hyperpolarization) 막전압을 발생시키는 포타슘통로의 생리적 역할에 따르면, 이들의 활성화는 CRAC channel을 통한 칼슘의 유입을 강화시키는데 있어서 중요하다10). 즉, 면역세포의 칼슘통로(CRAC)가 열린다 하더라도, 일방적인 양이온(Ca2+)의 유입은 세포막의 탈분극(depolarization)을 가져오면서 지속적인 유입에 스스로 제한을 두게 된다. 하지만 이러한 탈분극에 따라서 Kv1.3이 활성화되고, 또한 칼슘유입에 따라서 IKCa1/SK4이 활성화되어 과분극을 유지하게 되면 비로소 지속적인 칼슘유입과 면역세포 활성화가 가능해진다. 더욱이 최근에는 Kv1.3이 단순한 이온통로의 역할 뿐만 아니라, 면역세포 신호전달체계에서 중요한 스캐폴더의 역할을 하는 가능성11)이나 생체내 에너지대사 균형에도 관여하는 것이 보고되고 있다12).

글루코사민에 의한 이온통로 및 칼슘신호의 조절에 대한 연구는 매우 드물다. ADP에 의한 혈소판 활성화에 대하여 글루코사민은 억제적 효과를 가지는데, 혈소판 활성화에 필수적인 신호인 세포내 칼슘증가를 감소시킨다고 보고되었다13). 또한 뇌의 미세교아세포(microglia cell)에서 lipopolysaccharide(LPS)로 유도되는 세포내 칼슘 증가와 포타슘 외향전류가 글루코사민에 의하여 억제된다는 최근의 보고14)는 항염증 효과에 대한 새로운 기전의 가능성을 제시하였다. 본 연구에서는 이러한 배경지식과 최근 보고들을 바탕으로 human T 림프구 세포주인 Jurkat T cell에서 fura-2 형광분광법 및 팻취클램프 기법을 활용하여 세포내 칼슘신호 및 막전압의존성 K+ channel을 기록하고 이에 대한 글루코사민의 작용을 관찰하였다.

대상 및 방법

1. 실험 세포 및 배양조건

Jurkat T 세포주(clone E6-1)는 American type Culture Collection (Manassas, VA 20108, USA)로부터 구매하였으며 RPMI 1640 media (Gibco, Grand Island, USA)에서 배양하였다. 배양액에는 10% (v/v) heat-inactivated fetal bovine serum (Gibco), 1 mM sodium pyruvate (Gibco), 그리고 1% penicillin/streptomycin(Gibco)을 첨가하였다. 배양온도는 37℃를 유지하였고, 배양기내의 이산화탄소는 5% 분압을 유지하였다. T 림프구의 수용체(CD3)를 자극하기 위하여, anti-CD3 antibody (anti-CD3 Ab, 5 μg/mL)를 배양액에 첨가하고서 24시간 이상(24~36 h)이 지난 다음 실험을 수행하였다.

IKCa1/SK4 (mIKCa1) channel을 항구적으로 과발현하고 있는 HEK-293 세포주는 Dr. Kirang Park (Jusung University, Korea)으로부터 공여받았으며, 10% (v/v) fetal bovine serum(Hyclone), and 1% penicillin/streptomycin (Gibco)이 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 실제 실험을 수행할 때에는 HEPES로 완충된 생리식염수(PSS)에서 수행하였으며 PSS의 조성은 다음과 같다. 145 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM D-glucose. pH 7.4 적정은 NaOH를 사용하였다.

2. 세포막전압고정법을 통한 이온전류 측정

세포를 도립 현미경(Diaphot 300, Nikon, Japan) 위에 설치된 기록 용기 바닥에 뿌린 후 중력을 이용하여 PSS 용액을 대략 분당 2 mL의 속도로 흘려주면서 whole-cell patch clamp 방법15)으로 칼슘전류를 기록하였다. 이온전류는 실온(22~24℃)에서 기록하였다. 수직형 microelectrode puller (PP-83, Narishige, Japan)를 이용하여 피펫 끝의 저항이 2.5~3 MΩ되는 patch clamp용 유리 미세전극을 제작하였다. 유리 미세전극에 이온 전류 기록에 필요한 internal solution을 채운 후 patch clamp용 증폭기(Axopatch-1D, Axon Ins., USA)와 연결된 headstage에 연결한 후 미세조정기를 이용하여 세포에 접근시켰다. 이온전류를 기록하기 전에 증폭기에 있는 offset circuit을 이용하여 liquid juction potential을 교정한 후 전류를 기록하였다. 발생된 이온전류는 증폭기에 내장된 5 kHz (low-pass filter) 빈도의 여과기를 통하여 여과 후 기록하였으며, Digidata-1322A (Axon Instruments)를 이용하여 디지털부호화 한 다음 컴퓨터를 통해 관찰 및 저장하였다. 이온 전류의 기록 및 분석을 위하여 pCLAMP 프로그램(v.9.2, Axon Ins., USA)과 Origin 6.1 프로그램(Microcal Inc, Northampton, MA, USA)을 이용하였다.

3. 세포내 칼슘농도 ([Ca2+]c) 측정

[Ca2+]c 측정을 위하여 Jurkat T cell을 칼슘감지형광물질인 fura-2로 표식하였다. 세포부유액에 fura-2 acetoxymethyl ester(5 μM)을 첨가하고서 실온에서 30분간 기다리면서 fura-2가 세포 내로 들어갈 수 있도록 하였다. 이후 washed once with PSS로 세척하였다. 형광은 quartz microcuvette (1 mL)가 장착된 fluorescence spectrophotometer (Photon Technology Instrument, BiRmingham, NJ, USA)에서 측정하였으며 37℃로 온도가 유지되도록 하였다. 두 가지 파장(340과 380 nm)의 빛을 연속적으로 쬐어주면서(excitation) 이에 대한 형광반응값은 510 nm의 파장대에서(emission) 기록하였다. 칼슘농도의 변화를 비교하기 위한 표준화 과정으로서, 각 실험의 마지막 단계에서는 5 μM ionomycin와 5 mM CaCl2를 투여함으로써 최대 형광 비율(F340/F380 nm, Rmax)을 측정하고, 20 mM EGTA을 마지막에 첨가함으로써 최소형광비율(Rmin)을 얻었다. 칼슘농도는 Rmax와 Rmin을 각각 100%와 0%로 간주하고서, 백분율로 표준화하여 도시하였다.

4. 자료 분석

데이터는 mean±S.E.M. (n=sample 수)으로 표시하였다. 실험 성적은 Student's paired 혹은 unpaired t-test를 이용하여 분석하였으며, p 값이 0.05 미만일 때 통계적 유의성이 있다고 판정하였다.

결 과

T 림프구의 안정상태 칼슘농도(resting [Ca2+]c)는 80~120 nM 정도의 값을 보인다. Glucosamine 투여 자체는 이에 대하여 별다른 영향을 미치지 않았다. T 세포 수용체(TCR) 자극을 위하여 anti-CD3 Ab (5 μg/mL)를 투여하였다. 세포 내 칼슘농도는 그림1A와 같이 일과성의 상승 후에 일정 수준의 증가상태가 유지되는 모습을 보였다. 글루코사민 하이드로 클로라이드(GH) 500 μM을 전처치한 조건에서 TCR 자극은 대조군과 유사한 칼슘증가반응을 유발하였다(그림 1B). 장기간의 글루코사민 처리 후 TCR 자극에 의한 칼슘신호의 변화여부를 비교하여 보았다. 세포배양액에 100 μM 글루코사민을 첨가하고서 48시간 동안 배양 후, TCR 자극에 의한 칼슘신호를 관찰하였을 때 대조군에 비하여 유의한 차이를 발견할 수 없었다(그림 1C).

Figure 1.

Effects of glucosamine on the Ca2+ signaling induced by anti-CD3 Ab stimulation. The normalized fura-2 fluorescence ratios (%) reflecting the mean [Ca2+]i of Jurkat-T cells were averaged and plotted with error bars (n=3). (A) Application of anti-CD3 Ab (5 μ g/mL) induced an initial transient increase of fluorescence ratio followed by a partial recovery. (B) The acute pretreatment with glucosamine (0.5 mM) had no significant effect on the CD3-mediated [Ca2+]i increase. (C) The Jurkat-T cells pretreated with glucosamine for two days showed unchanged Ca2+ signaling in response to anti-CD3 Ab.

T 림프구에서 기록되는 voltage-dependent K+ current (IKv)에 대한 글루코사민의 작용을 관찰하였다. Whole-cell mode의 팻취클램프 기록 상태에서 막전압을 -80 mV에서 유지하다가 일정한 기울기의 탈분극 자극(ramp-pulse protocol)을 가하였을 때 기록되는 막전류를 전압에 대하여 도시하면 그림 2A와 같다. 이러한 전류-전압관계(I-V curve)에서 외향전류(수평선 위쪽으로 기록되는 전류)의 크기는 -30 mV에서 급격하게 상승하는 모습을 보였으며, 이는 막전압의존성 K+ 전류(IKv)의 전형적인 모습이었다. 글루코사민(500 μM)의 투여는 이러한 외향전류에 아무런 영향을 주지 않았다(그림 2A). 0 mV에서 측정한 외향전류 크기를 대조상태와 글루코사민 처치 상태에 대하여 각각 통계 값으로 정리하여 그림 2B에 정리하였다.

Figure 2.

Effects of glucosamine on voltage-gated K+ current (IKv) in Jurkat-T cells. (A) With Ca2+-free KCl pipette solution, ramp-like depolarization (from -120 to 60 mV) was applied to obtain a brief current to voltage relation (I-V curve) of outward current. (B) The outward currents measured at 0 mV in the presence of glucosamine (0.5 mM) were normalized to the control amplitude measured at the same voltage (I/Icon, %). Mean±S.E.M. (n=5).

위의 결과를 볼 때, 글루코사민은 T 림프구의 칼슘신호 및 Kv channel에 대하여 직접적인 급성 효과는 없는 것으로 생각되었다. 다음 단계로서, 글루코사민을 48시간 이상 세포배양액에 추가한 후 포타슘 통로의 변화 여부를 관찰하였다. 배양액에 글루코사민(100 μM)을 첨가하고서 48시간 후에 기록되는 IKv의 경우에도 의미있는 변화는 관찰되지 않았다(그림 3A). T 림프구의 막전압을 -60 mV에 고정하였다가 -50 mV로 순간적으로 변화시킨 상태에서 150 ms 동안 탈분극시킨 다음, 다시 원래의 유지전압(-60 mV)으로 되돌아왔다. 이러한 Step-pulse를 10초마다 반복하면서, 탈분극수준을 10 mV씩 높였다. 최종적인 탈분극자극이 +60 mV에 도달할 때까지 시행하였다(그림 3B~3D의 우측 상단에 표시된 pulse protocol 참조). 각 세포에서 이러한 막전압자극에 반응하여 나타나는 외향전류들을 겹쳐서 도시하였다(그림 3B~3D). 그림 3A는 이러한 반응들을 통계적으로 정리한 전류-전압관계 곡선이다. 즉, 각 탈분극 자극전압에서 기록되었던 전류의 최대크기들을 모아서 통계값으로 정리한 다음, 전압값에 대하여 도시한 것이다.

Figure 3.

Upregulation of IKv by chronic CD3 stimulation and the effect of glucosamine pretreatment in Jurkat-T cells. (A) I-V curves obtained by the step-like depolarizing pulses. Increase of IKv density by anti-CD3 Ab treatment (5 μg/mL, 24 h) is shown. I-V curves were averaged from anti-CD3 Ab only (n=8), glucosamine (0.1 mM, 2 d) combined with anti-CD3 Ab 1 d (n=8), control (n=8). (B~D) Representative current traces elicited by step-like pulses (see inset) in Jurkat-T cells cultured for 1 day in control condition (B), anti-CD3 Ab treatment (C), and glucosamine (2 d) combined with anti-CD3 Ab (D).

T 림프구에 대한 TCR자극이 24시간 이상 지속되면 T 세포 이온통로의 발현, 특히 IKv의 증가가 일어날 수 있다는 고전적인 보고가 있다16). 우리의 실험에서는 anti-CD3 Ab를 이용한 장시간 자극(>24~36 h)이 IKv의 크기를 2.5~3배 가량 증가시킨다는 것을 발견하였다. 이러한 TCR 자극에 의한 Kv발현 증가는 면역세포의 기능강화와 밀접한 관련이 있을 것으로 예상되었다. 따라서 이 현상에 대한 글루코사민의 작용을 관찰하였다. anti-CD3 Ab (5 μg/mL)와 함께 글루코사민(100 μM)을 함께 장시간 투여하였을 때에도 CD3 자극에 의한 IKv 증가는 여전히 일어났다. 그런데 비록 통계적으로는 유의하지 않았으나 TCR 자극만을 하였을 때에 비하여 IKv의 증가 정도가 약화되는 경향을 관찰할 수 있었다(그림 3).

마지막으로, T 림프구의 막전압조절 및 면역반응 조절에 중요한 역할을 할 수 있는 칼슘의존성 포타슘통로(KCa)에 대한 글루코사민의 작용을 살펴보았다. 면역세포에 발현되는 KCa는 IKCa1/SK4 아형에 속하는 것으로 잘 알려져 있다10,17). 본 연구의 재료였던 Jurkat T cell은 IKCa1/SK4 의 발현이 매우 낮은 상태였기 때문에 이 실험의 대상으로 적절하지 않았다. 따라서 IKCa1/SK4를 과발현시킨 세포주(HEK293)를 대상으로 inside-out patch 조건에서 실험을 수행하였다. 세포막 안쪽의 칼슘농도를 일정하게 유지시킨 상태에서 글루코사민의 효과를 정확하게 관찰하기 위하여 inside-out patch clamp 조건에서 실험을 수행하였다. Inside-out patch 조건에서 Ca2+-free 조건에서는 별다른 외향전류가 관찰되지 않았으나, 1 μM의 Ca2+이 존재하는 KCl 용액을 투여하면 외향전류가 크게 증가되었으며, 이것의 전류-전압곡선은 -85 mV에서 역전되는 경향을 보여서 K+에 선택적인 전류임을 확인할 수 있었다. 이처럼 IKCa1/SK4이 활성화된 상태에서 글루코사민 500 μM을 투여하였을 때 IKCa1/SK4의 전류크기는 적은 폭이지만 유의하게 감소하였다(n=4, 그림 4A, 4B).

Figure 4.

Effects of glucosamine on IKCa. (A) Representative traces of inside-out recordings obtained in the HEK-293 cells overexpressing IKCa1 with 0 or 1 μM of Ca2+ activity. The application of glucosamine (0.5 mM) in the high Ca2+ condition (1 μM) partially decreased the amplitude of IKCa1 current. (B) The outward currents measured at 0 mV in the presence of glucosamine were normalized to the control current, and the averaged values are plotted as a bar graph (n=5).

고 찰

본 연구에서는 글루코사민이 T 림프구에서 관찰되는 포타슘 이온통로 및 칼슘신호에 대한 억제효과를 가지는지 시험해 보았다. 서론에서 언급한 바와 같이, 글루코사민의 항염증효과가 이온통로 등을 매개로 일어날 가능성을 염두에 둔 실험이었다. 최근에 혈소판과 microglia cell13,14)에서 칼슘신호에 대한 억제효과가 일부 관찰된 보고들이 그러한 가능성을 시사하였다. 그러나 본 연구의 결과들은 글루코사민은 T 림프구의 칼슘신호와 Kv current에 의미있는 직접효과가 없음을 보여주었다. 다만, 칼슘의존성 포타슘통로인 IKCa1/SK4에 대하여 약간의 억제효과가 있음을 확인할 수 있었다.

T 림프구의 수용체(TCR) 자극을 유발하는 실험적 조건인 anti-CD3 Ab 투여는 처음의 빠른 일과성 칼슘농도 증가(initial Ca2+-transient) 후에 비교적 일정한 수준의 칼슘증가상태 유지(Ca2+-plateau)가 관찰되는 특성을 보인다. 이러한 변화는 각각 IP3-induced Ca2+ release와 store operated Ca2+ entry (SOCE)가 주된 메커니즘인데, 글루코사민은 이 두 반응에 모두 아무런 영향이 없었다. 본 연구결과에는 제시하지 않았으나, B 림프구의 칼슘신호에 대하여도 글루코사민의 작용여부를 테스트해 본 바 있었으며, mouse B 림프구 세포주인 WEHI-231과 Bal-17 모두에서 글루코사민(0.1~0.5 mM)은 유의한 작용을 보이지 않았다(data not shown).

결과에 기술한 바와 같이, IKv에 대한 글루코사민의 직접 효과는 없었으나, 한 가지 흥미로운 사실은 TCR 장기자극에 의한 IKv의 증가현상이 글루코사민으로 일부 둔화되는 경향을 보인 점이다. T 림프구의 이온통로에 대한 초기 연구결과들을 보면, mitogen을 투여하여 T 림프구를 자극시키면 IKv의 발현 정도가 증가한다는 현상이 보고된 바 있다16). 이후 이 현상에 대한 자세한 연구는 수행되지 않았으나, Kv1.3의 발현 증가로부터 미루어, 이에 대한 차단제가 T 림프구를 매개로 하는 면역반응을 줄여줄 가능성에 주목하게 되었다18,19).

본 연구결과에서는 PMA와 ionomycin이 아닌, 보다 생리적 자극인 anti-CD3 Ab를 이용한 T 림프구 자극에서 동일한 효과를 관찰할 수 있었다. 글루코사민을 병행 처리한 군에서는 비록 통계적으로 유의하지는 않으나, 그러한 K+ current 증가 효과가 음전압범위에서 둔화되는 경향을 보였다. 실제로 생리적 조건에서 IKv의 활성화를 일으킬 수 있는 세포막전압 범위는 -50 mV에서 -10 mV에 위치할 것으로 사료된다. 그러한 면에서 볼 때 글루코사민 장기투여의 효과는 흥미로운 점이 있다. TCR 자극, 특히 T 세포와 항원제시세포들 간의 자극은 세포막의 소위 ‘lipid raft domain’으로 주요 신호전달 분자들이 결집하는 것을 유도한다. 이러한 신호전달분자 군집(signaling complex) 형성에는 Kv 1.3 channel이 함께 중요한 역할을 한다는 보고가 있다11). 비록 자세한 세포생물학적 연구는 수행되지 못하였으나, 글루코사민의 48시간 전처리는 세포내 신호전달계를 억제하는 등의 효과를 통하여 IKv에 기능적 영향을 미칠 가능성을 배제할 수 없었다. 하지만 이 부분에 대하여 보다 자세한 추가 연구가 필요한 실정이다.

Kv1.3과 같은 면역세포의 voltage-gated K+ channel은 면역 반응 제어 및 조절의 중요한 타겟으로 주목 받고 있다. K+ channel 저해제가 다양한 전임상 실험에서 효력을 지님을 입증하는 결과들의 예로는 Kv1.3 차단제가 T cell-mediated autoimmune disease의 치료, 특히 다발성경화증(multiple sclerosis)에 대한 효과가 있음을 전임상 실험 등에서 보여주었다18,19). 또한 치주염에서 K+ channel 차단제의 효과가 제시되었다20). 심지어 Kv1.3의 경우에는 에너지대사와 비만방지의 가능성에 대한 제시도 함께 되고 있다12).

Kv1.3뿐만 아니라 IKCa1/SK4 또한 면역자극에 의하여 장기적으로 발현이 증가되며 이에 대한 차단제가 면역억제효과가 있다는 보고가 있다21). IKCa1/SK4는 Kv1.3과 함께 lipid raft에 국소적 분포가 관찰된다17). 이러한 면에서 볼 때 비록 본 연구에서는 약한 억제효과를 관찰하는데 그쳤으나, T 림프구의 IKCa1/SK4 channel에 대한 글루코사민의 조절효과를 찾는 더 강화시킬 수 있는 조건을 찾는 연구는 흥미로운 임상적 해석이 가능할 수 있을 것으로 사료된다.

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Figure 1.

Effects of glucosamine on the Ca2+ signaling induced by anti-CD3 Ab stimulation. The normalized fura-2 fluorescence ratios (%) reflecting the mean [Ca2+]i of Jurkat-T cells were averaged and plotted with error bars (n=3). (A) Application of anti-CD3 Ab (5 μ g/mL) induced an initial transient increase of fluorescence ratio followed by a partial recovery. (B) The acute pretreatment with glucosamine (0.5 mM) had no significant effect on the CD3-mediated [Ca2+]i increase. (C) The Jurkat-T cells pretreated with glucosamine for two days showed unchanged Ca2+ signaling in response to anti-CD3 Ab.

Figure 2.

Effects of glucosamine on voltage-gated K+ current (IKv) in Jurkat-T cells. (A) With Ca2+-free KCl pipette solution, ramp-like depolarization (from -120 to 60 mV) was applied to obtain a brief current to voltage relation (I-V curve) of outward current. (B) The outward currents measured at 0 mV in the presence of glucosamine (0.5 mM) were normalized to the control amplitude measured at the same voltage (I/Icon, %). Mean±S.E.M. (n=5).

Figure 3.

Upregulation of IKv by chronic CD3 stimulation and the effect of glucosamine pretreatment in Jurkat-T cells. (A) I-V curves obtained by the step-like depolarizing pulses. Increase of IKv density by anti-CD3 Ab treatment (5 μg/mL, 24 h) is shown. I-V curves were averaged from anti-CD3 Ab only (n=8), glucosamine (0.1 mM, 2 d) combined with anti-CD3 Ab 1 d (n=8), control (n=8). (B~D) Representative current traces elicited by step-like pulses (see inset) in Jurkat-T cells cultured for 1 day in control condition (B), anti-CD3 Ab treatment (C), and glucosamine (2 d) combined with anti-CD3 Ab (D).

Figure 4.

Effects of glucosamine on IKCa. (A) Representative traces of inside-out recordings obtained in the HEK-293 cells overexpressing IKCa1 with 0 or 1 μM of Ca2+ activity. The application of glucosamine (0.5 mM) in the high Ca2+ condition (1 μM) partially decreased the amplitude of IKCa1 current. (B) The outward currents measured at 0 mV in the presence of glucosamine were normalized to the control current, and the averaged values are plotted as a bar graph (n=5).